常見問題解答
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Q:
加入模板DNA的最低濃度是多少？是否DNA模板加入量和蛋白表達(dá)效率相關(guān)？
A:模板DNA濃度低于4 ng/μl，會降低表達(dá)量。模板DNA加入量和蛋白表達(dá)量有關(guān)，建議根據(jù)蛋白優(yōu)化，一般8 ng/μl左右就可以。
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Q:
相同模板的蛋白表達(dá)量組間差和批間差是否穩(wěn)定，是否有相關(guān)數(shù)據(jù)？
A:相同模板的蛋白表達(dá)量組間差和批次差相對穩(wěn)定，偏差約10%~20%左右。
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Q:
無細(xì)胞表達(dá)與傳統(tǒng)大腸桿菌表達(dá)的區(qū)別是什么？
A:對比項
無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)
傳統(tǒng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)
定義
無細(xì)胞蛋白表達(dá)屬于體外反應(yīng)系統(tǒng)，無需完整活細(xì)胞，直接利用細(xì)胞提取物（含核糖體、酶、tRNA、氨基酸等翻譯所需成分），在體外環(huán)境中完成轉(zhuǎn)錄和翻譯。
傳統(tǒng)大腸桿菌表達(dá)依賴活的大腸桿菌細(xì)胞，通過將目的基因?qū)爰?xì)胞，利用細(xì)胞自身的轉(zhuǎn)錄、翻譯機(jī)制（體內(nèi)環(huán)境）合成蛋白。
實驗流程
模版制備→無細(xì)胞反應(yīng)
質(zhì)粒構(gòu)建→轉(zhuǎn)化大腸桿菌→篩選陽性克隆→擴(kuò)大培養(yǎng)→誘導(dǎo)表達(dá)→收集細(xì)胞→裂解純化
耗費時間
1~2 h 即可表達(dá)出目的蛋白，8~16 h 即可達(dá)到最大量
時間數(shù)天到數(shù)周
特殊蛋白表達(dá)
可表達(dá)各種類型的蛋白，包括毒性蛋白、富含二硫鍵蛋白
或難溶蛋白
毒性蛋白、富含二硫鍵蛋白或難溶蛋白表達(dá)困難
操作便捷性
簡單快捷，開蓋即用，僅需加入 DNA 或 RNA 模板
對實驗條件和操作技能要求高
應(yīng)用靈活性
可使用 96 孔板或離心管進(jìn)行反應(yīng)，高通量篩選；修飾等更靈活
難以實現(xiàn)高通量表達(dá)和篩選
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Q:
合成的蛋白質(zhì)可以使用哪些方法純化？
A:可以使用鎳磁珠純化。
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Q:
是否需要在合成前純化質(zhì)粒或線性 DNA 模板？
A:說明DNA的質(zhì)量對無細(xì)胞很關(guān)鍵，可以使用高品質(zhì)的質(zhì)粒小量制備試劑盒或 PCR 和 DNA 純化試劑盒。
